急性骨髓性白血病幹細胞模式

幹細胞起源之首證

• 1997 年 Blair 等及 Bonnet、Dick 於 AML (acute myeloid leukemia) 首度發現幹細胞起源證據
  • 大部分白血病細胞無法廣泛增殖，僅部分細胞持續製造克隆
  • 確認小亞群人類 Thy1⁻ CD34⁺ CD38⁻ AML 細胞（0.2%～1.0%）
    • 唯一能移植人類 AML 至免疫缺陷小鼠者

正常血球幹細胞 (HSCs) 與祖細胞隔室

• 正常 HSCs (hematopoietic stem cells) 位置：Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻ CD90⁺ CD45RA⁻ 區域
• HSCs 衍生淋巴骨髓多能祖細胞 (lymphoid-myeloid multipotent progenitor cells, LMPPs)：Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻ CD90⁻ CD45RA⁻
• 更分化骨髓祖細胞：CD34⁺ CD38⁺ 隔室內
• 骨髓祖細胞分類（CD123/IL3RA、CD110/MPL、CD45RA 差異表達）
  • 常見骨髓祖細胞 (common myeloid progenitor, CMP)
  • 粒球-巨噬細胞祖細胞 (granulocyte-macrophage progenitor, GMP)
  • 巨核球-紅血球祖細胞 (megakaryocyte-erythroid progenitor, MEP)

AML 淋巴性啟動細胞 (leukemia-initiating cell, LIC) 定位

• 初步觀察：AML LICs 在 CD34⁺ CD38⁻ 隔室內
  • 意示 AML HSCs 為稀有細胞，最類似正常 HSCs
  • 共享有限免疫表型，為稀有族群
  • 但此結論過於簡化
• 後續資料揭示：
  • 任何骨髓惡性腫瘤起源 = 特定遺傳/表觀遺傳改變 + 該改變發生之細胞型態之組合
  • 使用更免疫缺陷型小鼠移植模式 → CD34⁺ CD38⁻ 及 CD34⁺ CD38⁺ 隔室細胞均具 LIC 活性
  • Vyas 等發現 CD34⁺ AML 內兩個擴張族群（均具 LIC 活性）
    • LMPP 樣漏斗淋巴幹細胞 (leukemic stem cell, LSC)
    • GMP 樣 LSC
    • LMPP-樣 LSC → GMP-樣 LSC（或直接產生 AML）

免疫缺陷小鼠模式演變

• 人類血球細胞移植至免疫缺陷小鼠 = 50 年來研究正常及惡性血液生成之重要檢測法
• SCID (severe combined immunodeficiency) 小鼠：首次突破
  • 人類骨髓細胞移植 → 再生 T、B 細胞（小鼠遺傳缺乏）+ 長期骨髓祖細胞生成
  • 限制：先天免疫功能高 → 人類植入受阻
• NOD-SCID 小鼠：克服
  • SCID 與具先天免疫缺陷之 NOD (non-obese diabetic) 小鼠回交
  • 支持更高人類植入率
  • 限制：胸腺淋巴瘤發展、NK (natural killer) 細胞持續活動
• NSG (NOD/SCID/γ-null) 小鼠：解決上述問題
  • IL-2 (interleukin-2) 受體共同 γ 鏈缺失 → B、T、NK 細胞完全喪失
  • 缺陷性細胞激素 (cytokine) 訊號 → 淋巴瘤生成預防
  • 支持更高人類供體細胞植入 = 評估癌幹細胞起始惡性腫瘤能力之檢測
• 人類化小鼠新進展
  • MISTRG 小鼠：表達人類細胞激素（與小鼠非交叉反應） → 刺激體內更多人類細胞生長
  • HLA (human leukocyte antigen) I/II 構成表達 → 強化 T 細胞功能
  • Sirpa 構成表達（巨噬細胞膜蛋白）→ 誘導對人類移植之耐受
  • KIT 原癌基因 (proto-oncogene) 受體酪胺酸激酶 (receptor tyrosine kinase) 喪失功能突變 → 無需受體小鼠照射即可建立 HSC 異種移植 (xenotransplantation)

不同髓系惡性腫瘤 LSCs 起源之示意圖

• (A) 某些急性/慢性髓系白血病
  • 遺傳證據：起始遺傳事件發生於 HSCs 富集細胞型態（Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻）
  • 例：AML/慢性骨髓白血病 (chronic myeloid leukemia, CML) 中 AML1-ETO、BCR-ABL 轉位 (translocation)
  • JAK2 V617F 突變 (mutation) 亦位於 HSCs
  • 侷限：單一突變可能不足以產生明顯 AML，可能導致
    • 異常自我更新（AML1-ETO）
    • 慢性骨髓增殖 (proliferation)（BCR-ABL、JAK2 V617F）
• (B) 其他 AML 型態
  • 遺傳改變獲得於比 HSCs 更分化之細胞型態
  • 例：急性前骨髓球白血病 (acute promyelocytic leukemia, APL) 中 PML-RARA 轉位在 Lin⁻ CD34⁺ CD38⁺ 細胞
• (C) 去新生 non-APL AML 患者比例
  • LSC 活性可能在異於 HSCs 之免疫表型細胞出現
  • 可能多種 LSC 族群，各具獨特免疫表型
• (D) 最新提案
  • AML 患者部分 HSCs 可獲得遺傳改變
  • 賦予異常自我更新特性 → 逐步積累遺傳改變 → 明顯惡性表型
  • 前白血病 HSCs 突變：DNA (deoxyribonucleic acid) 甲基化 (methylation)、組蛋白 (histone) 修飾相關基因
  • 明顯白血病突變：與細胞增殖增加相關遺傳改變

白血病致病效應與細胞起源

• 特定致癌基因 (oncogene) 之白血病致病效應 = 特定致癌基因 + 表達之靶細胞共同決定
• 結論：
  • 一致 LICs 最易定義於特定遺傳定義型白血病亞群
    • 特定慢性白血病（特定轉位或點突變）
  • 普通核型 AML 難以定義
• AML1-ETO 融合轉錄物 (fusion transcript) 例示
  • t(8;21) 轉位產生（AML 常見）
  • 可在白血病細胞及臨床緩解患者正常 HSCs 中偵測
  • AML1-ETO 表達 HSCs 非白血病，可體外分化為骨髓/紅血球細胞，類似無融合轉錄物之 HSCs
  • 小鼠內源 Aml1 基因位點表達 AML1-ETO 融合分析
    • AML1-ETO 表達 HSCs 具異常自我更新能力
    • 無其他遺傳異常時 不發展明顯白血病
  • 證據：HSCs 需獲得額外遺傳異常（或其後代）才能產生明顯白血病
  • 帶 AML1-ETO 融合之 HSCs 在 Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻ 亞族群（正常人類 HSCs 免疫表型）
    • → 起始病變需發生在具正常 HSCs 免疫表型之細胞
• 臨床變異與異質性
  • AML 患者 30～40% 白血病細胞不表達 CD34
  • 某些 AML 患者 LICs 實為 CD34⁻
  • APL：PML-RARA 轉位在 CD34⁻ CD38⁺ 族群（非 CD34⁺ CD38⁻ HSC 富集族群）
  • AML 細胞起源之巨大異質性 (heterogeneity) 確認

細胞起源之體內功能評估

• 早期 AML 癌幹細胞研究：AML 由 HSCs 內遺傳改變啟動
• 替代證據：某些白血病由已分化祖細胞內突變啟動
  • 該突變賦予異常自我更新能力（否則缺乏）
• 眾多研究直接測試：在隔離 HSCs、CMPs、GMPs 及更成熟骨髓細胞內選擇表達特定致癌基因
• MLL (myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia) 融合致癌蛋白實驗最透徹
  • MLL 編碼表觀遺傳酶 (epigenetic enzyme)（正常血液生成所需，HOX (homeobox) 基因表達維持角色）
  • MLL N-末端與>50 個 C-末端夥伴融合轉位 → AML、急性淋巴母細胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 常見
  • MLL-ENL 融合致癌蛋白高表達
    • 自我更新 HSCs 內 → AML 快速發作（體內）
    • 自我更新受限骨髓祖細胞內（CMPs、GMPs）→ AML 快速發作
  • MLL-AF9 及無關 AML 融合（MOZ-TIF2）逆病毒 (retroviral) 高表達 → 相似結果
  • BCR-ABL 高表達：僅轉化 HSCs，不轉化已提交下游祖細胞
• 明確證明
  • MLL 融合致癌蛋白轉化異於 HSC 之骨髓祖細胞族群 → 獲得白血病致病自我更新活性
  • 遺傳改變表達之細胞起源 → 調節惡性疾病發展能力
• 基因劑量重要性
  • MLL-AF9 在內源調控控制下表達
    • 轉化 HSCs（有效率）
    • 轉化部分 CMP 細胞（部分轉化）
    • 無法轉化 GMPs
  • 致癌基因表達劑量亦可調節細胞轉化

白血病細胞起源依賴於遺傳改變、細胞背景及基因劑量

• 原理：在小鼠血球幹細胞及祖細胞族群內逆病毒 (retroviral) 高表達多數白血病致病融合，再移植至受體小鼠
• 研究族群：HSC 富集 LSK (Lin- Sca-1+ c-Kit+) 細胞族群、CMPs、GMPs
• 發現：
  • 逆病毒 MLL-AF9 高表達 → 轉化 LSK、CMP、GMP 族群
  • 內源基因位點 MLL-AF9 表達 → 有效轉化 LSK，部分轉化 CMP，無法轉化 GMPs

癌遺傳改變定位技術進展與前白血病幹細胞

• 癌症遺傳改變製圖技術進步 → 精細追蹤 AML 及其他普通核型血液惡性腫瘤體細胞 (somatic cell) 突變
• 現信念：去新生 AML 成人平均 5 個編碼突變
• 多組研究：整體 AML 細胞及外觀未受影響 HSCs 內體細胞突變發生
  • AML 患者 HSC 隔室包含
    • 不含 AML 中任何突變之 HSCs
    • 含各種遺傳改變組合（與整體惡性細胞相似）之 HSCs
  • 後者理解為「前白血病幹細胞」
    • 啟動 AML
    • 可在緩解樣品中鑑定 → 存活誘導化療
    • 許多突變賦予生長特性 → 超越正常 HSCs 競爭 → 推測導致復發
  • 前白血病 HSCs 突變富集：DNA 甲基化、組蛋白 (histone) 修飾、內聚素 (cohesin) 複合物調節基因
  • 訊號啟動遺傳改變：通常位於更下游明顯惡性細胞，前白血病 HSCs 缺乏
• 近期 AML 單細胞突變分析：
  • 強化上述發現
  • 訊號基因突變（FLT3、NRAS、KRAS）常在 AML 亞克隆 (subclone) 內獲得
  • 可在多個不同亞克隆內獲得

前白血病幹細胞深層

• HSCs 特性
  • 稀有（～1～2/10⁸ 骨髓細胞）
  • 靜止，少分裂
  • 所有血細胞源自祖細胞 ← HSCs → HSCs 需複製/自我更新以續週期
• 突變在 HSCs 之累積
  • 細胞分裂期間發生
  • 單一突變縱能賦予生長優勢 → 不足轉化細胞 → 明顯惡性表型
  • 有時加速自我更新分裂 → 克隆性血液生成
• 前白血病幹細胞時間課程
  • 生長促進基因突變在癌症常見
  • 造成克隆性血液生成之 HSCs 突變 → 存在為前白血病幹細胞（白血病患者診斷前數月至年）
  • 後獲得合作驅動突變 → 癌症發展
• 健康人與致病傾向
  • 獲得體細胞突變導致克隆性血液生成 → 存在於健康個體（隨年齡頻率↑）
  • 克隆性血液生成患者血液惡性腫瘤風險 ↑（vs 配對對照）→ 白血病傾向證據
• 常見克隆性血液生成突變基因
  • DNMT3A (DNA methyltransferase 3A)、TET2 (tet methylcytosine dioxygenase 2)、SRSF2 (serine/arginine-rich splicing factor 2)、SF3B1 (splicing factor 3B subunit 1)、U2AF1 (U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1)、IDH1/2 (isocitrate dehydrogenase 1/2)、ASXL1 (additional sex combs like 1)
  • 亦見於骨髓惡性腫瘤反覆突變
  • 編碼蛋白：組蛋白 (histone) /DNA 表觀遺傳修飾、RNA 剪接 (splicing) 涉及
  • 功能實驗：DNMT3A、TET2 → 骨髓 HSCs 數量↑（分別由分化受損、自我更新↑）
• 前白血病幹細胞發展為白血病之病例
  • 至少某些情況：需獲得另一驅動突變（如 FLT3）
• 不同體細胞突變驅動之克隆性血液生成型態
  • 剪接因子突變（U2AF1、SF3B1、SRSF2）：專有>70 歲患者
  • 可能僅在老化血液系統選擇壓力下賦予生長優勢

相關連結

• 細胞起源研究
• 骨髓異形成症候群 (myelodysplastic syndrome)
• HSC (hematopoietic stem cell) 生物學
• 細胞分裂控制
• 本質血小板增多症之治療
• 臨床表徵與分子特徵
• 內皮細胞結構、功能與異質性 (heterogeneity)
• 本質血小板增多症之病理生物學
• 血球幹細胞之表型 (phenotype) 與定義

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