因子 IX 生物學

FIX 基因與 FIX 表現

• FIX 基因編碼 (F9)：
  • 1980 年代初由兩個研究小組分子克隆並定性
  • 位置：X 染色體 (X chromosome) Xq27 細胞遺傳位點
  • 大小：跨越 34 kb 基因序列（圖 134.5）
• 結構：
  • 八個外顯子 (exons)（前稱外顯子 A-H，現為外顯子 1-8）
  • 編碼 2.8 kb mRNA
  • 專一在肝細胞 (hepatocytes) 表現

圖 134.5

FIX 從 F9 基因衍化

上圖：F9 基因結構與 FIX 成熟過程

• 基因組成：外顯子 (exons) (1-8) 著色對應其譯出之域
  • 外顯子編號標於基因上方
  • 各域起始與終止胺基酸 (amino acid) 序號已標示
• FIX 合成步驟
  • 初始譯出產物：FIX 前體 (precursor)
  • 信號肽 (signal peptide) 移除 → FIX 原輔因子 (prothrombin)
  • 前肽導向 Gla 域中麩胺酸 (glutamic acid) 殘基的 γ-羧化 (γ-carboxylation)
  • 前肽移除 → 成熟 415 胺基酸蛋白
  • FXIa 在 Arg191 及 Arg226 處裂解 → 移除激活肽 (activation peptide)，留下主動蛋白酶 (protease)
• 備註：EGF，表皮生長因子樣 (EGF-like) 域

FIX 蛋白

• FIX 在血漿 (plasma) 循環濃度：約 5 μg/mL (90 nM)

• 成熟循環蛋白：

  • 415 胺基酸 (amino acid) 組成
  • 分子量 57 kDa（圖 134.5）

• 合成初始形式：前-前肽鏈

  • 短信號序列 (signal sequence)（促進進入 ER）
  • 前肽序列 (propeptide sequence)（與 ER 中 γ-麩胺基羧化酶互作）

• 後轉譯修飾 (post-translational modification)：

  • 微粒體酶催化 12 個 N 端麩胺酸 (glutamic acid) 殘基轉變為 γ-羧基麩胺酸殘基 (γ-carboxyglutamic acid residues)（Gla 域）
    • 使 FIX 能與鈣依賴性原凝血性磷脂膜互作（見第 125 章）
  • 第 64 位成熟 FIX 的第一個 EGF 樣 (EGF-like) 域：天冬醯胺 (asparagine) β-羥化 (β-hydroxylation)
    • 亦促進鈣及磷脂膜互作

• FIX 分子排列：

  • N 端 Gla 域
  • 兩個 EGF 樣 (EGF-like) 域
  • 激活肽 (activation peptide)
  • 羧基端催化域 (catalytic domain)
  • 組織類似原凝血因子 (prothrombin) VII、X 與抗凝蛋白 (anticoagulant) C（見第 125 章）

• 催化特性：

  • 所有絲氨酸蛋白酶 (serine protease) 特徵：催化三元組 (catalytic triad) His267-Asp315-Ser411
  • 三殘基形成酵素活性位點 (active site)
  • 負責 FX 中 Arg234-Ile235 裂解鍵的裂解 (cleavage)（激活所需）

• FIX 酶原激活路徑：

  • FXIa 媒介之蛋白溶解裂解 (proteolytic cleavage)
  • FVIIa-組織因子 (tissue factor) 複合體類似過程

• FIX 激活機制：

  • 連續蛋白溶解兩個肽鍵 (peptide bonds)：Arg191-Ala192 及 Arg226-Val227（圖 134.5）
  • 移除 FIX 激化肽 (activation peptide)
  • 形成二硫結合 (disulfide-linked) FIXa 酵素
    • NH₂ 端輕鏈 (light chain)（經鈣調節經由 Gla 域結合原凝血性磷脂表面）
    • COOH 端重鏈 (heavy chain)（催化域）

• 反應特性：

  • C 端催化域 (catalytic domain) 裂解並激活受質 (substrate) FX
  • 涉及內源凝血酶 (thrombin) 複合體，FVIIIa 為必要輔因子 (cofactor)
  • 無 FVIIIa → 反應催化效率 ↓ 約 20 萬倍

FIXa 經由與天然抗凝蛋白 (antithrombin, AT) 互作而被抑制 (inhibited)。FIXa-AT 複合體的結局尚未完全明瞭，但肝細胞表面的特異 AT-蛋白酶受體 (protease receptor) 參與此過程。

甲型血友病 B 的病理生理

• 血友病 B 責任變異 (pathogenic variants)：
  • 迄今所有變異涉及 F9 基因
  • 遺傳分析：>98% 病例偵測到 F9 基因變異
  • 剩餘變異：可能位於內含子 (intron) 序列，標準技術難以檢測（圖 134.6）

圖 134.6

F8 及 F9 變異不同類型在重症甲型及重症乙型血友病之頻率

重症甲型血友病(A 圖)：倒位 (inversion) 變異(I-22 及 I-1) 佔所有病例 44%，錯義 (missense) 變異佔約 17%。重症乙型血友病(B 圖)：近 50% 病例因錯義變異所致。

• 與甲型血友病相異：

  • 甲型：~50% 重症變異由兩個常見基因倒位 (inversion) 事件所致
  • 乙型：~75% 變異為錯義 (missense) 替代

• F9 變異特性：

  • 無共同常見 F9 變異
  • 輕型血友病 B 在某些族群可見創始者效應 (founder effect)

• 血友病 B 變異類型：

  • 主要：錯義 (missense) 變異
  • 其他：大基因缺失 (deletion)、無義 (nonsense)、插入/缺失 (indel)、剪接 (splice) 變異混合

• 完整 F9 變異陣列：可查詢網際網路資料庫 http://f9-db.eahad.org/

• Leyden 血友病 B（最生物學上卓越變異）：

  • 變異位置：40 bp F9 啟動子 (promoter) 區域破壞
  • 影響：該區域含肝臟轉錄因子 (transcription factor) 結合位點（負責兒童早期基因表現）
  • 特性：變異保留啟動子中的雄激素 (androgen) 應答元件 (response element)

• 臨床表現：

  • 青春期及以後：隨著雄激素 (androgen) (睾酮 testosterone)濃度 ↑，基因表現趨於正常
  • FIX 濃度變化：自生時 <5% 逐漸 ↑ 至早成年期 >30%

• 自然史：

  • 嬰幼兒期：早期 FIX 濃度低 → 出血事件符合中等血友病 B
  • 青春期後：FIX 濃度與出血表型改善甚至解決 → 血友病標籤常被移除

• 血友病 B 與 FIX 抗體 (antibody) 形成：

  • 關聯：自 1980 年代 F9 基因克隆後已公認
  • 錯義 (missense) 突變：低風險抑制劑發展
  • 大缺失 (deletion) 突變：較高風險（30-50%）

• 抗體特性：

  • 中和 (neutralize) FIX 酵素功能
  • 可與 FIX 輸注的過敏性或類過敏反應相關
  • 通常於幼兒(1-2 歲) FIX 濃縮液 10-20 次暴露後發展

• 臨床影響：

  • FIX 濃縮液使用通常不再有益
  • 誘導 FIX 免疫耐受 (immune tolerance) 可被腎病症候群發展複雜化

• 詳細討論：見血友病 B 抑制劑章節

• 歐洲皇室血友病 B：

  • 過去與許多歐洲皇室家族相關的出血疾患
  • 臨床圖象符合重症血友病，正式診斷報告於 2009 年

• 「皇家」F9 變異：

  • 位置：內含子 (intron) 3 末端 3' 端
  • 機制：剪接 (splice) 異常 → 創造新剪接受體 (acceptor) 序列
  • 結果：小說出框轉錄加 11 個新胺基酸後有早期停止密碼子 (stop codon)
  • 預測：異常 FIX mRNA 無義 (nonsense)-介導衰減 (decay) → 重症表型

• F9 基因其他位置錯義 (missense) 變異：

  • 啟發蛋白結構與功能理解
  • 激活肽 (activation peptide) 裂解位點變異已有記載
  • 常見「熱點」變異：含 CpG 二核苷酸序列的精氨酸 (arginine) 密碼子

血友病診斷 (Hemophilia Diagnosis)

• 血友病初始診斷時機：
  • 取決於家族背景
• 有家族史患者：
  • 家族諮詢 (genetic counseling) → 決定血友病傳遞風險
  • 通常診斷於子宮內或新生兒早期
• 無家族史患者：
  • 診斷時機：出血跡象出現
  • 診斷延遲程度取決於因子缺乏程度
  • 重症缺乏：通常生後 1-2 年內診斷
  • 中等疾患：診斷可延遲
  • 輕型血友病：診斷可延遲至成年期外科介入後出血發生

血友病的表型診斷 (Phenotypic Diagnosis of Hemophilia)

• 血友病診斷方法：
  • 血小板貧乏血漿 (platelet-poor plasma) 中測量 FVIII 或 FIX 凝血活性
  • 使用功能凝血試驗 (functional coagulation assay)
• 試驗類型：
  • 單階段 PTT（凝血為基礎）：多數臨床止血實驗室使用
  • 兩階段或色譜法 (chromogenic) 試驗：測量純化系統中 FXa 產生（見第 127 章）
• 試驗特性及注意：
  • 色譜法試驗孵育時間常較長 → 可能影響結果
  • 不穩定 FVIII 合成例：A2 域從蛋白其餘部分增強分離 (dissociation)（圖 134.7）
    • 單階段試驗可能遺漏
    • 兩階段或色譜法試驗易見（延長孵育時間）
• 臨床建議：
  • 輕型/中等甲型血友病診斷：單階段試驗後亦執行色譜法試驗
  • 目的：更好決定缺乏程度

圖 134.7

B 域缺失 (B-domain deletion) 因子 VIII (FVIII) 結構之帶狀表示

域著色與標籤

• 變異位置標記：紅球標示結果血友病 A 古典試驗差異的變異位置

• 變異分佈特徵

  • 聚集位置：域間邊界
  • 主要位置：A2 與 A1 或 A3 域間

• 分子機制

  • 殘基突變削弱共價鍵 (disulfide bonds) 繫留 A2 域於 A1/A3 創造的杯狀結構
  • 結果 → 更迅速分離 (dissociation) 與活性喪失

• 試驗差異

  • 孵育時間短的凝血試驗：突變蛋白有更高活性
  • 孵育時間長的色譜法試驗：活性下降明顯
  • 原因：分離 (dissociation) 時間依賴性

• 血友病嚴重程度分類（基於凝血因子濃度）：

  • 重症 (severe)：<1% (<0.01 IU/mL)
  • 中等 (moderate)：1-5% (0.01-0.05 IU/mL)
  • 輕型 (mild)：>5%-40% (>0.05-0.40 IU/mL)

• 新生兒血友病 B 診斷注意事項：

  • 新生兒 FIX 濃度低 → 因其未成熟麩胺基羧化酶系統
  • FIX 濃度變化：生後前數年倍增，持續緩慢升高至青春期
  • 臨床影響：初始標籤可能隨後重分類
    • 中等血友病患童 → 輕型血友病
    • 輕型血友病患童 → 正常 FIX 濃度

• 正常值參考：

  • 新生兒 FIX 濃度：>20% 視為正常
  • 12 個月齡 FIX 濃度：>30% 視為正常

血友病的遺傳診斷 (Genetic Diagnosis of Hemophilia)

• 血友病遺傳診斷：DNA 分析 (DNA analysis)

• 進展：自 1980 年代初 FVIII 與 FIX 基因克隆以來，分子遺傳方法血友病診斷已劇烈進展

• 已知突變數量：

  • 3,000 種不同 F8 突變與甲型血友病相關

  • 1,000 F9 突變記載於乙型血友病

• 遺傳分析策略：

  • 取決於血友病類型及表型嚴重程度

• 甲型血友病：

  • 重症患者應初始篩檢常見倒位 (inversion) 突變
    • F8 內含子 (intron) 22 倒位
    • F8 內含子 1 倒位

• 乙型血友病：

  • 多數患者需完整序列分析 (sequence analysis)
    • FIX 啟動子 (promoter)
    • FIX 編碼區 (coding region)
    • FIX 剪接位點 (splice sites)

• 產前診斷 (prenatal diagnosis)（若已辨認家族性突變）：

  • 絨毛膜融毛膜取樣 (chorionic villus sampling)
  • 羊膜穿刺 (amniocentesis)

• 血友病突變測試其他應用：

  • 家族計畫攜帶者偵測 (carrier detection)
  • 抑制劑發展風險分析成份（見血友病攜帶者偵測與產前診斷)

• 臨床標準：決定血友病基因型現視為照護標準

血友病的鑑別診斷 (Differential Diagnosis of Hemophilia)

• 血友病初始臨床懷疑來源：

  • 過度出血跡象與症狀
  • 出血問題家族史
  • 異常凝血試驗結果

• 血友病初始實驗室篩檢：

  • PTT (partial thromboplastin time) 延長

• 確認步驟：

  • PTT 與對照血漿 (control plasma) 混合 → 正常化提示 PTT 延長因子缺乏
  • 測量因子濃度確定原因

• 鑑別診斷：

  • FVIII 或 FIX 缺乏 (deficiency)
  • FXI 或 FXII 缺乏
  • 各種凝血因子聯合缺乏 (combined deficiency)（見第 135 章）

• 低血漿 FVIII 濃度：非血友病 A 診斷同義詞

• 鑑別診斷（見表 134.3）：

  • FVIII <10%：
    • 最常：遺傳或後天甲型血友病(成人) 或重症 VWD(第 1 型或第 3 型)
    • 決定 VWF 抗原 (antigen) 及活性濃度 → 區分必需
    • 亦可：第 2N 型 VWD（見第 133 章）
      • FVIII 結合研究 (binding study) 確認
      • VWF 基因型分析 (genotyping)（外顯子 17-25 FVIII 結合密碼子，D'D3 區）
  • FVIII 10-50%：
    • 可能：輕型甲型血友病或 VWD(第 1 型或 2A、2B、2M、2N 變異)
    • VWF 濃度評估必需
  • 罕見：FVIII 與 FV 聯合遺傳缺乏 (combined inherited deficiency)
    • 濃度通常 5-20%
    • 盛行率約 100 萬分之一
    • 病因：LMAN1 或 MCFD2 隱性 (recessive) 突變
      • 涉及蛋白運輸跨 ER-高爾基體 (Golgi) 介面

表 134.3

低因子 VIII 濃度的鑑別診斷

FV，因子 V (Factor V)；FVIII，因子 VIII (Factor VIII)；VWD，馮威利佰蘭德疾病 (von Willebrand disease)。

• 孤立低血漿 FIX 濃度：
  • 幾乎總由先天血友病 B (congenital hemophilia B) 所致
• 後天血友病 B (acquired hemophilia B)：
  • 罕見（與後天甲型血友病相反）
  • 因：針對 FIX 的自身抗體 (autoantibodies) 發展
• 其他 FIX 缺乏情況：
  • 通常涉及維生素 K 依賴凝血因子伴隨減少
  • 原因：維生素 K 拮抗劑 (vitamin K antagonist)、維生素 K 缺乏、重症肝病 (severe liver disease)（見第 126 章）
• 罕見：遺傳聯合維生素 K 依賴凝血因子缺乏 (combined vitamin K-dependent factor deficiency, VKCFD)
  • 表現：所有維生素 K 依賴蛋白輕型缺乏（FII、VII、IX、X）
  • 病因：γ-麩胺基羧化酶 (GGCX) 基因常染色體隱性 (autosomal recessive) 缺陷
    • 編碼必需後轉譯修飾的 γ-羧化酶 (γ-carboxylase)